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本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取革兰氏阳性菌基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，能够高效专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。使用本试剂盒提取的基因组DNA可用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

• 溶菌酶使用前需要用50%甘油配制成20mg/mL，建议现用现配，或者分多次配制。
  
• 使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签（每瓶需要单独加入45mL无水乙醇）。
• 所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
  
• 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。
  
• 若试剂盒中的溶液出现沉淀，可在65℃水浴中重新溶解后再使用，不影响提取效果。
  
• 如果实验中的离心步骤出现柱子堵塞的情况，可适当延长离心时间。

• 取细菌培养液1mL，12000rpm离心1min.，尽量吸除上清。
  
• 向菌体中加入200μL溶液A，振荡或用移液器吹打使菌体充分悬浮，随后加入50μL溶菌酶，37℃处理30min以上。
  
  • 如果需要去除RNA，可加入2μL RNaseA溶液。
• 向管中加入20μL的蛋白酶K，充分混匀，55℃消化30～60min，消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止，此时可见菌液呈清亮粘稠状。
  
• 向管中加入200μL溶液B，充分颠倒混匀。
  
  • 如出现白色沉淀，可于75℃放置15～30min，沉淀即会消失，不影响后续实验
    
  • 如果溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能会导致DNA的提取量以及纯度降低，还可能堵塞吸附柱。
• 向管中加入200μL无水乙醇，充分混匀。
  
  • 此时还可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入到吸附柱中，静置2min。
• 12000rpm离心2min.弃废液，将吸附柱放入收集管中。
  
• 向吸附柱中加入600μL漂洗液(使用前请先检查是否己加入无水乙醇)。12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
  
• 向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm离心lmin，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
  
• 12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟。
  
  • 此步骤的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR等。
• 将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50～200μL经65℃水浴预热的洗脱缓冲液，室温放置5min，12000rpm离心1min。
  
  • 洗脱液的体积最好不少于50μL，体积过小会影响回收效率。
    
  • 洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率。
    
  • DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
• 离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，即可得到高质量的细菌基因组DNA。

得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1.0相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。OD260/0D280比值应为1.7～1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。